📊 АНАЛИЗ ВЕСТЕРН-БЛОТА с использованием программного обеспечения ImageJ // Метод, не одобренный Н...

Подпишитесь, чтобы узнать больше о увлекательном подходе к изучению лабораторных методик:    / @adwoabiotech   ImageJ — это общедоступная программа, разработанная Уэйном Расбандом во время работы в Национальных институтах здравоохранения (NIH). В NIH рекомендован процесс количественной оценки полос, который отличается от показанного в этом видео. Я подготовил руководство по протоколу, основанному на рекомендациях NIH, здесь:    • ⚖️ QUANTIFYING WESTERN BLOT BANDS with IMA...   . . В этом видео мы рассмотрим преобразование изображений гелей вестерн-блота в числовые данные, с которыми можно выполнять математические операции, то есть проводить количественное сравнение. Мы будем использовать ImageJ — бесплатную программу для обработки изображений, разработанную Национальными институтами здравоохранения и Лабораторией оптических и вычислительных приборов. Для изображений, полученных с помощью микроскопа, также доступна версия ImageJ FIJI с поддержкой плагинов. FIJI обладает дополнительными функциями, уже встроенными в программу. При анализе данных вестерн-блота референтные белки, такие как глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAPDH), B-актин или альфа-тубулин, используются для компенсации неравномерной загрузки или переноса белков во время настройки. Это позволяет устранить изменения/различия в результатах анализа, которые могут быть вызваны вариабельностью во время процедуры вестерн-блота и не иметь биологического значения. Обратите внимание, что могут существовать различия в клеточной экспрессии выбранного референтного белка, а также условия эксперимента могут по-разному влиять на экспрессию референтного белка. Следовательно, вам может потребоваться дополнительное исследование, чтобы убедиться в валидности выбранного референтного белка. В связи с этим в качестве референтного белка для нормализации все чаще используется общий перенесенный белок. Кроме того, важно не перегружать (не насыщать) референтный белок и загружать его в количестве, соответствующем линейному диапазону. В представленном здесь примере лизат белка, используемый для вестерн-блота, был загружен в одну лунку, поэтому не требовалось корректировать неравномерную загрузку между лунками/образцами. Вестерн-блоттинг включает разделение белков с помощью детергента додецилсульфата натрия (SDS) и полиакриламидного геля в процессе, известном как электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ). После разделения белки из геля переносятся на мембрану, например, нитроцеллюлозную или ПВДФ, для более удобной и надежной работы с белками. Перенесенный интересующий белок можно обнаружить с помощью специфического зонда, например, антитела. Визуализация самого антитела облегчается путем связывания с флуорофором или ферментом. Наиболее распространенными ферментами, связанными с антителами, являются пероксидаза хрена (HRP) и щелочная фосфатаза. Радиоизотопы также широко использовались в прошлом. Для количественной оценки различных количеств белка, обнаруженного антителом, используется программное обеспечение, такое как imageJ, которое преобразует сигнал в числовое значение. После получения числовых значений различных количеств белка прямые сравнения возможны только после нормализации значений. Концепцию нормализации данных лучше всего объяснить на примере: Предположим, взрослый прыгнул на 150 см, а 10-летний ребенок – на 120 см. Кто прыгнул дальше всех? На основании предоставленной информации можно предположить, что взрослый прыгнул дальше всех. Однако, если учесть рост ребенка (90 см) и взрослого (171 см), ситуация меняется. Взрослый прыгнул на 0,87 от своего роста, а ребенок – на 1,2 от своего роста. Таким образом, нормализация учитывает начальные значения/состояние (базовый уровень) до определения увеличения или уменьшения в результате условий эксперимента. Альтернативный метод, показанный в этом видео, — это расчёт площади. Этот метод полезен, когда на дорожке имеется несколько полос вестерн-блота, которые представляют собой отдельные белки и, следовательно, не могут быть рассчитаны как интегральная плотность. Я сделаю отдельное видео на эту тему. . . . . . . . . / Это видео посвящено вестерн-блоттингу и гель-электрофорезу, количественному анализу в SDS-PAGE, теории и методу вестерн-блоттинга, пошаговому анализу вестерн-блоттинга, результатам вестерн-блоттинга и их интерпретации, нормализации вестерн-блоттинга и изображению вестерн-блоттинга.