Твердофазный синтез олигонуклеотидов: фосфорамидитный метод

Фосфорамидит — это довольно круто, правда? Он помогает нам записывать ДНК или РНК! Твердотельный синтез олигонуклеотидов, включая фосфорамидитный метод, может использоваться компаниями для производства больших объемов коротких последовательностей ДНК или РНК (олигонуклеотидов или «олиго»). Поэтому я решил сделать вам одолжение и рассказать о том, что может произойти, когда вы закажете свои ПЦР-праймеры! Блог (текст старый, видео): http://bit.ly/solidstateoligo «Нуклеиновые кислоты» включают ДНК и РНК и состоят из нуклеотидных букв. Нуклеотиды состоят из сахара (рибоза в РНК и дезоксирибоза в ДНК), соединенного с уникальным азотистым основанием (A, C, G или U (или T в ДНК)) и фосфатом(ами). Если у вас нет фосфата(ов), вы называете это нуклеозидом. Существует большая разница между тем, как нуклеотиды добавляются в клетки, и тем, как они добавляются посредством химического синтеза… Ваши клетки могут копировать существующую ДНК (в ДНК или РНК) только потому, что они полагаются на существующий шаблон. При использовании методов твердофазного синтеза для создания коротких фрагментов ДНК или РНК (олигонуклеотидов или «олиго») шаблона нет, вы просто вводите буквы по одной, поэтому вы можете написать «что угодно». Но вам нужно строго контролировать этот процесс, потому что, поскольку нет шаблона, нет возможности «проверить» — поэтому вы должны убедиться, что лишние буквы не задерживаются, и вы должны убедиться, что буквы правильно соединены — в ваших клетках белки обеспечивают эту специфичность, потому что, когда они удерживают буквы в дополнительном положении, доступен только правильный способ. Этот процесс включает в себя множество этапов и довольно длинные химические названия, но, как и в большинстве реакций химического синтеза, в основе лежит «простая» логика: → скрыть то, что не нужно изменять (ЗАЩИТА), и сделать то, что нужно изменить, более легко изменяемым (ИЗБИРАТЕЛЬНАЯ ДЕПРОТЕКЦИЯ) → добавить что-то для изменения (СОЕДИНЕНИЕ) → удалить непрореагировавшие вещества (ЗАКРЫТИЕ) → повторять цикл, пока не будете удовлетворены результатом → удалить любые «скрывающие вещества», которые не нужны в конечном продукте (ПОЛНАЯ ДЕПРОТЕКЦИЯ) → очистить (ОБЕЗСОЛЬ, очистка методом ВЭЖХ/ПАГ и т. д.) Аналогичные методы можно использовать для ДНК и РНК, но если вам нужна РНК, вам придется заплатить гораздо больше! ДНК и РНК отличаются одним атомом кислорода (буква D означает «дезокси»), однако ДНК, полученная на заказ, дешева, а РНК дорога! Дело не только в том, что РНК круче (хотя это так) или потому, что кислород очень дорогой, а в том, что этот кислород может делать… он любит отталкивать своих соседей, разрывая цепочку написанных букв или присваивая её себе… Поэтому, когда компании синтезируют РНК с помощью твердофазного олигонуклеотидного синтеза, им приходится защищать РНК от самой себя – и защищать свою прибыль… Мы используем числа со знаком «штрих» («‘»), чтобы указать, где что-то отходит от сахара – мне нравится представлять нуклеозиды как маленьких человечков, у которых левая рука – это 5’, правая рука – 1’, правая нога – 2’, а левая нога – 3’. Разница между РНК и ДНК (помимо разницы между U и T) заключается в том, что у РНК есть ещё одна ОН-группа в качестве «правой ноги», тогда как у ДНК есть только водород (H), который часто даже не изображается, а лишь подразумевается. Какую разницу может внести кислород? ОГРОМНУЮ! В твердофазном синтезе олигонуклеотидов вы химически скрываете (блокируете/защищаете) или «открываете» (дезащищаете) эти «руки» и «ноги», чтобы направлять их соединение. Но в РНК вам нужно «закрепить» две «ноги», а не одну, и вам нужно удерживать одну из этих «ножек», пока вы снимаете другую. Потому что эта «правая нога» может дать толчок растущей цепи или украсть её у левой! В форме нуклеозидов, используемых вашими клетками, фосфатная (PO4-) «рука» прикреплена к 5'-руке, а гидроксильная (-OH) «ножка» — к 3'-руке. В клетках, таких как бактерии, которые мы используем для амплификации плазмид, или в ПЦР, белок полимераза помогает связывать нуклеотиды вместе, образуя фосфодиэстерные связи между фосфатом одного нуклеотида (прикрепленным к 5'-участку сахара) и 3'--OH следующего. В химическом синтезе их добавляют в виде модифицированных «нуклеозидфосфорамидитов» — вместо того, чтобы фосфатная группа исходила из «левого плеча» (5’), она исходит из «левого звена» (3’). И они добавляются «справа налево» 3’→5’, но конечные продукты одинаковы. Примечание: важным следствием этого является то, что начало вашего ДНК или РНК олигонуклеотида будет иметь 5’OH вместо 5’ фосфата(ов), если вы не заплатите им дополнительно за его добавление. Это не единственное различие — поскольку у вас нет полимеразы, зависящей от матрицы, вам приходится управлять процессом и следить за тем, чтобы все шло как надо. Завершено в комментариях